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多中心非小细胞肺癌研究,鹍远基因OncoAim?肿瘤突变panel检测性能优异!

2020年2月7日,由四川大学华西医院牵头,北京大学第三医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、空军军医大学西京医院、浙江大学附属第一医院等参与的多中心临床研究发表在Nature旗下期刊Scientific Reports上。该研究利用鹍远基因的OncoAim®肿瘤突变panel对来自这些医院的近500份非小细胞肺癌(NSCLC)患者FFPE样本进行了检测,相关性能表现非常出色。

Scientific Reports官网截图

这项研究应用鹍远基因自主研发的OncoAim®肿瘤突变panel(以下简称“OncoAim®”)基于高通量测序技术(NGS),对452例NSCLC患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本进行了基因检测,并验证了OncoAim®的检测性能。结果显示,对于覆盖深度> 500×、等位基因频率(mutations with allele frequency,MAF)≥5%的NSCLC基因突变,OncoAim®肿瘤突变panel的总体检测性能十分强大,具体表现为灵敏度> 99%,特异性>99%,以及94%的准确性和96%的可重复性。除此之外,该研究还描述了中国NSCLC患者基因组突变的新特征。

一、研究样本有哪些特征? 

该研究所检测的FFPE样本来自于从2013年至2016年4家合作医院的病理档案,452例NSCLC患者FFPE样本的纳入标准具体为:(1)患者明确诊断为“非小细胞肺癌”;(2)5年内取样;(3)肿瘤细胞含量≥20%。病理学家检查了4μm的苏木精-伊红染色切片,以确保样本体积≥1mm3,有核细胞率≥80%或≥30000个细胞以及肿瘤细胞含量≥20%。同时,收集临床病理信息用于关联分析。

二、研究是怎样进行的? 

研究人员对FFPE样本提取DNA后,进行了文库制备和高通量测序,然后使用OncoAim panel管线对测序数据进行了分析,每个基因座的中位覆盖范围为500–1000x, SNV和INDEL的最小突变MAF设置为5%,以确保可靠地检出突变。最后根据6种商业文库参考标准(HD200、HD300、HD301、HD706、HD802和HD260),该研究评估了OncoAim®对FFPE标本中的点突变(single nucleotide variants ,SNV)以及基因插入/缺失(short insertions and deletions ,INDEL)的检测性能。


图1 NSCLC-FFPE样品NGS分析工作流程

在性能验证方面,研究团队对敏感度与特异性分析是这样进行的:

检测到参考标准中的突变,视为真阳性(TP, true positive)未检测参考标准中的突变,视为假阴性(FN,false negative)。用检测到的次数/采样次数,计算每个测试点的灵敏度。

进行特异性分析时,检测到的突变是参考标准或亲本细胞系中的已知突变,视为TP;如果检测到的突变不是已知突变,则视为假阳性(FP,false positive)阳性预测值(Positive predictive value,PPV)计算为TP/(TP+FP)

三、研究有哪些惊喜结果? 

1.OncoAim®在SNV检测方面具有高灵敏度和高特异性

对于OncoAim®SNV方面的检测性能(敏感性和特异性),研究团队使用了4种单独的参考标准(即HD200,HD300,HD301和HD802)和4种混合参考标准(即HD300-HD706,HD802-HD260,HD301-HD706和HD200-HD706)。这些参考文库共拥有54种已知的SNV,MAF范围为1%~70.0%,中位测序覆盖深度为1025×~1469×。

结果发现,OncoAim®对整体SNV的检测性能很高:MAF≥5%时成功检测出了99%(40/40)的预期SNV,并且在MAF <5%的情况下也发现了79%(11/14)的SNV变化。此外,当PPV> 99%(51/51)时,可保持高特异性。 

随后,通过随机二次采样数据,研究团队评估了测序覆盖深度(50~1000x)和MAF对SNV检测的影响。随着所有MAF区段的覆盖深度增加(<5%,5-10%和≥10%),检测灵敏度稳步提高,中位覆盖深度为500x时,可达最高灵敏度(图 2A) 。MAF≥5%,中位覆盖深度为500x时OncoAim®成功检测到预期SNV中的> 99%(400/400)。此外,在整个覆盖深度范围内,PPV仍然很高(> 99%)。该研究还发现,在检测SNV时,预期和观察到的MAF之间有很高的相关性(图2C),突出了OncoAim®检测稳定的定量特征。


图2  OncoAim®对SNV和INDEL检测性能(SNV面板A,C;INDEL面板B,D)

2.OncoAim®在INDEL检测方面具有高灵敏度和高特异性

为了对OncoAim®进行INDEL检测验证,研究团队使用了3个单独的参考标准(即HD200,HD300和HD802)和3个混合参考标准(即HD200-HD706,HD300-HD706和HD802-HD260)。这些参考文库包含7个已知的INDEL,其MAF和INDEL的长度范围很广(3~15bp)。6个样品的平均测序覆盖深度为1232x。

研究团队观察到了OncoAim®较高的整体检测性能:MAF≥5%时,成功检测到了>99%(5/5)的预期INDEL,PPV也>99%(5/5)

通过二次采样数据,研究团队评估了测序覆盖深度和MAF对INDEL检测性能的影响。在MAF≥5%时,INDEL检测灵敏度随覆盖深度的增加而增加,并且在中位覆盖深度达到700x时可观察到高灵敏度,即成功检测到> 99%的INDEL(15/15)。在低MAF(<5%)时,随着覆盖深度的变化,检测灵敏度的波动趋势(图 2B)。此外,在整个覆盖范围内,PPV可达到85~100%。同样地,INDEL的检测与预期MAF之间的相关性也很高(图 2D),再次说明OncoAim®有稳定的定量特征。

3.OncoAim-NGS检测与ARMS-PCR检测一致性高达94%

众所周知,ARMS-PCR(扩增阻滞突变系统PCR)有操作简单、快速、灵敏度高(可检测低至1%的突变)等优点,但检测通量低、不能检测未知突变也是ARMS-PCR技术的固有缺点。

研究团队使用OncoAim-NGS检测和ARMS-PCR技术测试了253个NSCLC FFPE样本的EGFR突变状态,两种技术共检测到126个EGFR突变,其中这两种技术都检测到的突变有119个,一致性达94%(图  3)。通过ARMS-PCR检测到6个突变,未被NGS发现。研究团队认为,这可能是由于这些突变的MAF过低和/或肿瘤异质性所致。NGS也检测到了一种未被ARMS-PCR发现的TP53突变,这一突变在Sanger测序中被确认。


图3 OncoAim和ARMS-PCR检测NSCLC FFPE样本的一致性

4.OncoAim-NGS在FFPE样本中具有可重复性,结果高度一致

研究团队用具有5种已知改变的3个FFPE肿瘤样本评估了OncoAim®肿瘤靶向试验的精密度,即其再现性和重复性。在这5种已知的突变中,KRASEGFR的突变是由ARMS-PCR方法检测的,TP53突变用NGS(Illumina-Miseq平台)检测。

在3个不同的实验中,研究团队对样本进行了5次分析,以评估运行间和运行内的再现性。最终结果显示,重复检测分析之间的一致性为96%,而且运行间和运行内的重复没有显著差异,这些结果充分证明了OncoAim®NGS测序的稳定性。

5.绘制了中国非小细胞肺癌患者的基因突变谱

在452份FFPE样本中,有30份因DNA质量差、文库浓度低、中位阅读覆盖率和一致性低等原因未能成功测序,最终有422份样本成功测序,用于后续变异分析。随后,研究团队利用OncoAim®分析了422例中国非小细胞肺癌患者的突变情况。

最终,研究团队发现,在422个FFPE样本中,约有70%(295个)具有至少1个突变,总共检出了21个基因中的479个突变。用单个基因突变数除以患者数计算的基因突变频率为0.24%~50%。前5个突变最频繁的基因是EGFR(211,50%),TP53(149,35%),KRAS(24,5%),PIK3CA(21,5%),以及PTEN(16,4 %)(图  4)。此外,研究还发现,一些患者有不止1个EGFR突变,从176个样本中检测到211个EGFR突变;还有一名患者被发现有2个PTEN突变。


图4 该研究NSCLC患者的突变的基因、像差数和突变频率

如图5所示,错义突变(Missense mutation)是几乎所有前10位突变基因中最普遍的形式,但PTEN基因例外,其突变类型以框内插入( in-frame-insertion)为主。在EGFRTP53突变中,框内缺失(In-frame-deletion )和无义突变(nonsense mutation)排在第二位。KRASPIK3CANFE2L2CTNNB1的所有突变均为错义型。


图5 Oncoplot描述NSCLC患者最常见的前10个突变基因

6.NSCLC患者的临床特征与基因突变有密切的关联

这项研究评估了NSCLC患者基因突变与性别、年龄、吸烟等临床特征之间的关联,但在不同的肿瘤部位(左肺与右肺)未发现基因突变的差异。

01突变与性别

该研究观察到,女性患者的EGFR突变频率明显较高,而TP53PTEN的突变频率则明显较低(图6),与先前的其他研究报道一致。有趣的是,PTEN突变在男性患者中更为普遍。


图6 不同性别患者的基因突变频率

02突变与年龄

与中年组(45~65岁)相比,年轻组(18~45岁)的EGFR突变率显著降低,结果与其他研究一致。与中老年组(> 65岁)相比,青年组中TP53突变的频率较低。


图7 不同年龄组患者的基因突变频率

03突变与吸烟

吸烟是肺癌的重要危险因素。这项研究中,吸烟者KRAS突变频率增加,与其他报告一致。但是,PIK3CA像差与吸烟状态呈正相关,这与之前对日本肺癌患者的研究不一致,该研究认为这种不同的结果可能是种族差异造成的。

04突变与转移

淋巴结转移是不良预后的有力独立预测因子。这项研究发现,发生淋巴扩散的肺癌富含EGFRTP53突变,表明具有EGFRTP53突变的肺部肿瘤更有可能发生转移性肿瘤,预后可能较差。先前的研究报告已经证实了EGFR表达水平在患有淋巴结转移的肺癌患者中更高,这项研究进一步巩固了这些发现。

我们都知道,肺癌在晚期倾向于扩散到其他身体部位,形成转移性肺肿瘤。该研究的发现是,与原发性肺肿瘤相比,转移性肺肿瘤的EGFR突变频率更高。这提醒我们,对于具有EGFR驱动基因突变的原发性肺肿瘤患者,应仔细筛查和监测潜在的转移情况。

05突变与肿瘤组织学等级

肺癌的组织学等级是患者存活率的独立预测因子。这项研究观察到,分化良好的肿瘤与中分化肿瘤相比,EGFRTP53的突变频率明显更低。与低分化肿瘤相比,高分化肿瘤还具有较低的EGFRTP53突变频率,但这些差异未达到显著水平。研究团队认为,高分化肿瘤中EGFRTP53的低突变频率可能代表了更好的预后指标。

06突变与肿瘤组织学亚型

腺癌(ACA)和鳞状细胞癌(SCC)是NSCLC的两种主要组织学亚型,它们具有独特的基因表达谱,且有不同的临床意义。

这项研究发现,EGFR突变在ACA中更为普遍,但TP53PIK3CANFE2L2的突变在SCC中富集。这些结果表明,在ACA中,RTK(受体酪氨酸激酶)信号通路激活丰富,而PI(3)K通路激活、氧化应激通路激活和TP53通路抑制在SCC中更为普遍。尽管之前已经报道过每种基因之间的相关性,但这项研究首次揭示了这4种基因在肺癌队列研究中的组织学亚型关联。转录因子NFE2L2在调节参与抗氧化和应激反应的基因表达中起着关键作用,检测到D29Y、D29H和R34Q变体(第2外显子)可能提示肺癌预后不良。

7.NSCLC患者的基因突变间有互斥和共存现象

这项研究的数据表明,EGFRKRASTP53NFE2L2BRAF为互斥突变(图  8)。EGFRKRASBRAF突变之间有相互排他性,是已知的。这项研究为NFE2L2突变与EGFR突变不共存提供了第一个证据,巩固了NFE2L2突变的致癌性。另一有趣的发现是,TP53突变与EGFR突变相互排斥,达到了显著水平。这一新的观察结果在一定程度上支持了RASTP53在急性髓性白血病中表现出相互排斥性的发现,这表明单独灭活TP53可能足以使肺癌细胞增殖并避免凋亡。


图8 NSCLC患者基因突变中的互斥与共存

注:A.Oncostip图显示了样本中所有突变的分布,样本中EGFRTP53KRASPTENNFE2L2BRAF中至少有一个畸变。B. 描述了互斥的基因对或同时存在的基因对。

研究团队还观察到, PTEN突变倾向于与BRAF突变一致(图8)。PTEN突变可导致PI(3)K通路的激活,虽然在肺癌中尚未见到PTENBRAF突变共存的研究报道,但PIK3CA突变与BRAF突变有关。此外,在黑色素瘤中,功能丧失PTEN突变和BRAF激活突变可以共存。这些结果表明,在某些类型的肺癌中,通过PTEN突变导致抑制丢失而激活PI(3)K信号通路,可以与BRAF依赖的RTK信号通路激活协同促进肿瘤的发展。

四、小结 


图片 | 站酷海洛

随着精准医疗的发展与NGS技术革新,基因检测已经成为用于肺癌诊断的不可缺少的工具。在这项多中心合作的研究中,研究团队首先基于FFPE样本对OncoAim®进行了广泛的性能评估,然后探讨了中国NSCLC患者的基因突变特征。

整个NGS过程的运转时间约为2-3天。该研究证明了,OncoAim®对SNV和INDEL都具有很高的灵敏度、特异性、准确性和精密度,假阴性结果主要出现在低频变异(MAF <5%)。检测灵敏度随着测序覆盖深度的增加而提高,在一定覆盖深度(SNV为500x,INDEL为700x)下,MAF≥5%变异体的检测灵敏度高达100%,而且在整个测序覆盖范围(50-1000×)上均获得了高特异性。对于MAF≥5%的突变,OncoAim®检测与ARMS-PCR检测显示出高度的一致性(94%),表明OncoAim®检测的精度很高。两者合计,可以得出结论,基于NGS的OncoAim®检测在FFPE样本中具有强大的性能。

OncoAim®涵盖了中国最常见的6种癌症类型(食道,胃,肝,肺,乳腺和结肠)的常见突变,包括59个癌症基因中的6000个热点。因此,除肺癌外,OncoAim®检测还可应用于其他癌症。其中,OncoAim®在结直肠癌方面的多中心研究相关数据已经在2018年发表于欧洲病理协会旗下的核心期刊Virchows Archiv

资料来源:

Jiang, R., Zhang, B., Teng, X. et al. Validatinga targeted next-generation sequencing assay and profiling somatic variants inChinese non-small cell lung cancer patients. Sci Rep 10, 2070(2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-58819-5

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