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游离DNA是一种极具吸引力的标志物


于那些不太熟悉游离DNAcfDNA)的人来说,cfDNA是从自然或非自然死亡的细胞中释放的DNA。这些cfDNA从血液中被清除只需要很短的时间,仅仅几个小时就够了。因为不断有细胞死亡,也就不断有cfDNA被清除。


液体活检成功的希望是测试血浆中的循环肿瘤DNActDNA)。GRAILFreenome两家公司正在努力开发针对ctDNA的癌症筛查测试。其中GRAIL已投入了数十亿美元,麻省理工学院出版的<<技术评论>>对这项研究做了精彩的报道。


此外,目前液体活检开发者和治疗选择提供者也在不断前进。Guardant Health 在201810月中旬成功首次公开募股,并宣布了研究中的消息。Foundation Medicine的液体活检(现更名为FoundationOne Liquid)作为“突破性技术”快速通过了FDA审批。


所有这些大公司都在寻找指示癌症的驱动突变。例如MET基因可在癌症中扩增;因此如果检测到MET基因的水平高于其他正常基因的基线水平,这就是个体患有癌症的信号。


迄今已经发现约140个癌基因突变后可以驱动肿瘤发生;而这些基因可以受到多种突变的影响,这意味着多种单一突变(如单核苷酸变异、插入与缺失、拷贝数变异、结构变异)的数量会比较大。尽管如此,从功能上而言,作为肿瘤抑制基因的TP53可以被多种方式灭活;因此作为癌症标志物的TP53去抑制也是癌症可以发生的140种方式之一。

系统生物学思维

癌症基因突变影响许多其他基因。自20世纪90年代后期出现全基因表达微阵列后,对全基因组基因表达的研究一直在进行。今天,对它的研究方法已经发生了变化,而其中的RNA-Seq主要应用了NGS技术;由于其分辨率越来越精细,已实现单细胞RNA-seq,它已成为一种非常流行的技术。


回到最初,我们看看这些基因如何在细胞中被调节。根据中心法则,遗传信息DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质;而胞嘧啶的去甲基化可以给出信号,提示从它所在的基因DNA转录RNA


因此,观察外周血中ctDNA的甲基化状态将能够寻找癌症组织中增多或减少的基因;而且它们不仅仅是那140个肿瘤驱动关键基因,还包括数千个相关基因。

什么是ctmDNA?以前没有测过ctmDNA吗?

通过观察ctmDNA(循环肿瘤甲基化DNA),癌症信号的'搜索空间'140个基因增加到数千,增加了几乎100倍。而且你可以'看到'整个基因网络的打开和关闭。因此在寻找ctRNA标志物的同时(Predicine是一家将cfDNAcfRNA分析结合起来的公司),cfDNA中的甲基化标记物为查找疾病特征信号提供了一种极具吸引力的新方法。


拥有100倍以上的标志物意味着ctmDNA具有内置冗余,也就是说,即使癌症的“网络式”信号中有单个节点缺失,整个网络仍然能够被识别。这就好比一个有1,400块的拼图,其中有一块或十块缺失,你仍然可以识别整张照片。



甲基化研究历史悠久。以往流行多年的方法是焦磷酸测序以及甲基化特异性实时PCR。诸如Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip的微阵列实现了更广泛的甲基化测量范围。随着NGS的出现,称为RRBS(简化亚硫酸氢盐测序)的全基因组方法进一步扩大了范围,能够分析大约400万个CpG位点,大约是基因组中所有甲基化位点的三分之一。


而全基因组甲基化测序虽然技术上可行,但是因为无法对基因组内感兴趣的目标CpG区域进行选择,使得测序总成本过高。


有了所有这些技术,为什么cfDNA甲基化作为一种潜在的癌症生物标志物还是没有普及呢?这主要是因为在甲基化检测过程中还有两个技术限制。


首先是亚硫酸氢盐处理。它通过化学反应将DNA中未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶,后者在测序中作为胸腺嘧啶被读出;但是亚硫酸氢盐严重损伤DNA。所以如果一开始可用的循环肿瘤DNA很有限,那么经过处理后很可能无法检测到任何DNA突变。


第二是测量方法。微阵列和实时PCR测量的是单个CpG,会丢失单倍型信息(如在DNA链上的相邻关系,即一条连续的DNA链上多个CpG位点的甲基化状态)。焦磷酸测序和RRBS会读出这些信息,但是在数据的生物信息分析中,这些信息往往在第一步就被丢弃了。

鹍远基因检测cfDNA的甲基化单倍型

通过测量cfDNA中的ctmDNA,鹍远基因已经能够观测20,000个甲基化单倍型信号(这一数字会随着技术进步继续增加),从中进一步观察外周血中上调或下调的整体基因网络。


在研究癌症组织样品时,小批量(约数十个)癌变和健康组织将以非靶向的通用的甲基化单倍型分析流程进行分析。鹍远基因的标准生物信息学分析流程将NGS数据中的甲基化单倍型信号,按照良性组织和恶性组织分组构建分类器,并选择鉴别两组样本的甲基化单倍型。


鹍远基因还可以较为方便地定制测试:它可以用于检测更大批量的恶性和健康组织样本,以进一步改进分类器;也可以用于检测临床样品。我们将在以后进一步介绍此类测试的细节。


现在鹍远基因为市场提供了一种用于研究新型生物标志物的新工具。使用这一工具开发的泛癌筛查(PanSeer)和结肠直肠癌筛查(ColonES)的结果令人印象深刻,提示是一个好的开始,而未来更加值得期待。